病毒VdCV1的OTU基因对植物病毒的影响及转基因黄萎菌的研究

【摘要】本实验室从棉花黄萎菌中发现了真菌病毒Verticilliumdahliaechrysovirus1(VdCV1)，推测其中包含OvarianTumorprotease(OTU蛋白酶)基因，但对OTU基因功能尚未做实验证实。为此，本文开展VdCV1的OTU基因对植物病毒的影响及转基因黄萎菌研究，以期探明OTU基因在VdCV1-黄萎菌-棉花互作中的功能。在VdCV1的OTU基因表达对植物病毒的影响研究方面，通过将OTU基因插入到狗尾草花叶病毒(Foxtailmosaicvirus,FoMV)及黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）F209-Δ2b中，构建OTU基因的病毒表达载体pCB301-FoMV-OTUp193、pCB301-F209-Δ2b-OTUp193，结合实验室已有对照载体及pCB301-F209-Δ2b-GFP、pCB301-FoMV-GFP，实验设计农杆菌浸润本生烟，分析OTU基因表达对FoMV病毒复制酶RdRp的RNA量的影响，分析OTU基因表达对重组病毒pCB301-FoMV-GFP、重组病毒CMV的GFP表达的影响，从而分析OTU基因对病毒的作用。研究结果：Northern杂交分析表明，OTU基因对病毒FoMV的RdRp具有增强稳定性的作用；荧光检测及Western杂交分析表明，OTU基因表达对重组病毒pCB301-FoMV-GFP的GFP荧光表达具有增强作用，并对重组病毒CMV（F209-Δ2b-GFP，F109，F309）的GFP荧光表达也具有增强作用，证明了OTU基因对病毒复制的增强作用。另外，通过Northern杂交实验分析结果表明，OTU基因表达降低植物病程相关基因NtPR1a表达量，表明OTU基因表达降低植物的免疫力。在转基因黄萎菌研究方面，我们将OTU基因和小片段基因OTUp193替代载体pHMG中以Pmg1基因为启动子的GFP基因，构建OTU基因的真菌表达载体pHMG-OTU和pHMG-OTUp193，通过农杆菌转化法（ATM）将质粒pHMG、pHMG-OTU、pHMG-OTUp193和pBHt1转入黄萎菌T-9中。研究结果：荧光检测表明获得了能发出绿色荧光的转GFP基因黄萎菌菌株；证明了Pmg1启动子能用于黄萎菌的遗传转化；基因组DNAPCR检测表明获得了转OTU基因、转OTUp193基因黄萎菌株及pBHt1质粒转化黄萎菌菌株，但结果还有待进一步研究分析。
【作者】张斯；
【导师】竺锡武；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】OTU基因；病毒；转基因；棉花黄萎菌；病毒载体；

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